Reporter-based reverse genetics of murine norovirus reveals insertion-tolerant sites and a position in the capsid linked to antibody escape
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2026
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Zusammenfassung
Noroviruses are members of the Caliciviridae family: positive-sense, single-stranded RNA encased within a 90 dimer protein capsid. Human norovirus (HNoV) is a major cause of gastrointestinal disease. Murine norovirus (MNV) is used as a surrogate in the study of HNoV due to it being the only norovirus currently reliably cultivatable in cell culture and possessing a reverse genetics system. Previous studies have used MNV to develop our understanding of norovirus capsid protein structure with regards to infection. Various ligands have been observed to bind the norovirus capsid including divalent cations, neutralising antibodies, bile acids, and a cellular receptor mCD300lf (MNV only). The effect of bile acids on MNV infection was previously investigated in this lab but recent research suggests dynamic conformational changes observed in the MNV capsid are due to environmental factors such as bile acid binding, pH change and divalent cation binding. This study set out to determine the effects of divalent cation binding with regards to infection.
Multiple reverse genetics techniques have been developed for MNV with an RNA-based technique in a recombinant cell line developed within the last few years. This technique allows for the indirect observation of protease production via a GFP reporter system. This work compared wild‑type MNV‑1.CW1 RNA transfections with transfected MNV‑1.CW1 RNA with mutations introduced to a cDNA plasmid construct via site-directed mutagenesis. This system was used in the testing of the non‑structural (NS) polyprotein, protease cleavage sites with the aim of identifying potential sites for the insertion of a short protein-coding sequence, and to generate recombinant mutant MNVs used in the study of divalent cations.
Transfection experiments of MNV‑1.CW1 RNA with an HNoV protease cleavage site identified a potential site of NS1‑2/NS3 as being suitable for a potential inserted protein, with the site receptive to a short peptide coding sequence insertion. Five recombinant MNV‑1.CW1s with mutations in the major capsid protein were generated. The generation of two divalent cation non-binding mutants (D410A and D440A) and the extensive testing of these in cell culture assays identified D440 as a crucial site of cation binding, preventing the neutralisation of the virus with a monoclonal antibody. Previous work identifying bile acid in preventing neutralisation from monoclonal antibodies was revaluated, this time controlling for divalent cations. Divalent cations were found to be essential in small concentrations – that alone could not prevent neutralisation – but assisted bile acid in neutralisation escape.
Beschreibung
Noroviren gehören zur Familie der Caliciviridae: positivsträngige, einzelsträngige RNA, umhüllt von einem 90-Dimer-Proteinkapsid. Das humane Norovirus (HNoV) ist eine der Hauptursachen für Magen Darm-Erkrankungen. Das murine Norovirus (MNV) wird aufgrund seiner derzeit einzigen zuverlässigen Kultivierbarkeit in Zellkulturen und seines reversen genetischen Systems als Ersatz für die Untersuchung von HNoV verwendet. In früheren Studien wurde MNV verwendet, um unser Verständnis der Struktur des Norovirus-Kapsidproteins im Hinblick auf Infektionen zu vertiefen. Es wurde beobachtet, dass verschiedene Liganden an das Norovirus-Kapsid binden, darunter zweiwertige Kationen, neutralisierende Antikörper, Gallensäuren und ein zellulärer Rezeptor mCD300lf (nur MNV). Die Wirkung von Gallensäuren auf die MNV-Infektion wurde bereits zuvor in diesem Labor untersucht, aber neuere Forschungen deuten darauf hin, dass die im MNV-Kapsid beobachteten dynamischen Konformationsänderungen auf Umweltfaktoren wie Gallensäurebindung, pH-Änderung und zweiwertige Kationenbindung zurückzuführen sind. Diese Studie hatte zum Ziel, die Auswirkungen der zweiwertigen Kationenbindung in Bezug auf die Infektion zu bestimmen.
Für MNV wurden mehrere Techniken der reversen Genetik entwickelt, darunter eine RNA-basierte Technik in einer rekombinanten Zelllinie, die in den letzten Jahren entwickelt wurde. Diese Technik ermöglicht die indirekte Beobachtung der Proteaseproduktion über ein GFP-Reporter-System. In dieser Arbeit wurden Wildtyp-MNV-1.CW1-RNA-Transfektionen mit transfizierter MNV-1.CW1-RNA verglichen, in die durch ortsspezifische Mutagenese Mutationen in ein cDNA-Plasmidkonstrukt eingeführt worden waren. Dieses System wurde zum Testen des nicht-strukturellen (NS) Polyproteins und der Protease-Spaltstellen verwendet, um potenzielle Stellen für die Insertion einer kurzen proteinkodierenden Sequenz zu identifizieren und rekombinante mutierte MNVs zu erzeugen, die in der Untersuchung von zweiwertigen Kationen verwendet wurden.
Transfektionsexperimente mit MNV-1.CW1-RNA mit HNoV-Protease-Spaltstelle identifizierten eine potenzielle Stelle von NS1-2/NS3 als geeignet für ein potenziell eingefügtes Protein, wobei die Stelle für die Insertion einer kurzen Peptid-Codierungssequenz empfänglich war. Es wurden fünf rekombinante MNV-1.CW1 mit Mutationen im Hauptkapsidprotein erzeugt. Die Erzeugung von zwei Mutanten, die keine zweiwertigen Kationen binden (D410A und D440A), und deren umfangreiche Prüfung in Zellkultur-Assays identifizierten D440 als eine entscheidende Stelle für die Kationenbindung, die die Neutralisierung des Virus durch einen monoklonalen Antikörper verhindert. Frühere Arbeiten, in denen Gallensäure als Mittel zur Verhinderung der Neutralisierung durch monoklonale Antikörper identifiziert wurde, wurden neu bewertet, diesmal unter Berücksichtigung zweiwertiger Kationen. Es wurde festgestellt, dass zweiwertige Kationen in geringen Konzentrationen unerlässlich sind – allein konnten sie die Neutralisierung nicht verhindern –, aber sie unterstützten die Gallensäure bei der Neutralisationsumgehung.
Schlagwörter
norovirus, murine, reverse genetics, divalent cations, glycochenodeoxycholic acid, mCD300lf, protease cleavage, antibody escape
Zitierform
Institut/Klinik
Institut für Virologie und Zellbiologie