Exploring structure-based discovery of antivirals targeting Human cytomegalovirus (HCMV)
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Datum
2025-07-28
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Zusammenfassung
Human cytomegalovirus (HCMV) causes widespread infections globally, typically remaining asymptomatic and latent. However, under conditions of immunosuppression, HCMV can reactivate and cause severe disease. The United States Food and Drug Administration (USFDA) has approved six antivirals for prevention and/or treatment of HCMV infection: Ganciclovir, Valganciclovir, Cidofovir, Foscarnet, Letermovir (only prophylaxis), and Maribavir. Despite their efficacy, these antivirals face one or more of the following challenges: toxicity, efficacy, and the emergence of drug resistance. This highlights the urgent need for novel antivirals that are both effective and safer, targeting essential viral proteins to minimize resistance.
This study aimed to extend the available HCMV drugs by establishing structure-based drug design pipeline for three distinct HCMV protein targets, namely the pUL94/pUL99 complex, pUL98 and pUL77. I worked towards the structural characterization of two HCMV targets, employing crystallization methods in combination with crystallization enhancing scaffolds as “crystallization chaperones” as well as alternative methodologies like cryo-EM single particle analysis. The resulting atomic structures will pave the way for virtual screening of small molecules to identify potential antiviral candidates. Additionally, we aimed to establish a semi-automated virtual screening workflow and screen for protein-protein interaction inhibitors against HCMV pUL77.
I initially expressed pUL98 in E.coli and purified it to homogeneity. Since initial robotic crystallization experiments remained unsuccessful, I employed sybodies and megabodies as “crystallization chaperones” for pUL98. Unfortunately, crystallizing pUL98 with sybodies or megabodies did not yield diffraction-quality crystals.
For the pUL94/pUL99 complex sybodies were already available at the beginning of this thesis, and as crystallization also remained unsuccessful, we started a collaboration with the group of Maya Topf at CSSB; Hamburg, to characterize the complex structure using cryo-EM single particle analysis. To increase particle contrast in cryo-EM, I used the existing sybodies to engineer legobodies binding pUL94/pUL99, but the complex showed significant compositional and conformational heterogeneity, limiting the obtained resolution to ~6Å.
Finally, I used the reported cryo-EM structure of the pUL77 pentamer to establish a consensus virtual screening workflow for pUL77 using multiple scoring functions, docking tools and additional screening parameters. This allowed us to identify consensus poses from two docking tools and attempt to improve probability of true-positive hits. Clustering algorithms were used to scrutinize the molecules further, enhancing the hit identification rate and lead selection. The shortlisted molecules from this screening workflow have been ordered and will be tested by our collaboration partners in cell culture models for HCMV infection.
In conclusion, this work established a workflow for virtually screening molecules with improved hit rates, moving beyond reliance on docking scores alone. This workflow aims to enhance the efficiency of structure-based antiviral discovery targeting HCMV infection.
Beschreibung
Das Humane Cytomegalievirus (HCMV) verursacht weltweit verbreitete Infektionen, die typischerweise asymptomatisch verlaufen und in derem Rahmen das Virus in einem latenten Zustand im Wirt verbleibt. Unter Immunsuppression kann das Virus jedoch reaktiviert werden und schwere Erkrankungen hervorrufen. Die United States Food and Drug Administration (USFDA) hat sechs antivirale Wirkstoffe zur Prävention und/oder Behandlung von HCMV-Infektionen zugelassen: Ganciclovir, Valganciclovir, Cidofovir, Foscarnet, Letermovir (ausschließlich zur Prophylaxe) und Maribavir. Trotz ihrer Wirksamkeit ist die Anwendung dieser antiviralen Therapeutika durch eine oder mehrere der folgenden Herausforderungen eingeschränkt: Toxizität, eingeschränkte Effektivität sowie die Entstehung von Arzneimittelresistenzen. Dies unterstreicht den dringenden Bedarf an neuartigen antiviralen Wirkstoffen, die sowohl hochwirksam als auch sicherer sind und essentielle virale Proteine gezielt inhibieren, um das Risiko einer Resistenzentwicklung zu minimieren.
Ziel dieser Studie war es, das bestehende Spektrum an HCMV-Therapeutika durch die Etablierung einer struktur-basierten Arzneimittelentwicklungs-Pipeline für drei distinkte HCMV-Proteinziele zu erweitern: den pUL94/pUL99-Komplex, pUL98 und pUL77. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die strukturelle Charakterisierung zweier dieser HCMV-Zielproteine verfolgt, wobei Kristallisationsmethoden in Kombination mit sogenannten „crystallization chaperones“ sowie alternative Verfahren wie der Einzelpartikelanalyse mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (cryo-EM) zum Einsatz kamen. Die resultierenden atomaren Strukturen sollen ein virtuelles Hochdurchsatz-Screening für niedermolekulare Verbindungen ermöglichen, um potenzielle antivirale Kandidaten zu identifizieren. Darüber hinaus verfolgten wir das Ziel, eine teilautomatisierte virtuelle Screening-Workflow zu etablieren und spezifische Inhibitoren der Protein-Protein-Interaktion gegen pUL77 zu identifizieren.
Zunächst exprimierte ich pUL98 in E. coli und konnte es bis zur Homogenität reinigen. Da erste robotergestützte Kristallisationsversuche erfolglos blieben, wurden Sybodies und Megabodies als kristallisationsfördernde Chaperone für pUL98 eingesetzt. Leider führten diese Ansätze nicht zur Bildung von Kristallen mit ausreichender Qualität.
Für den pUL94/pUL99-Komplex standen zu Beginn der Arbeit bereits Sybodies zur Verfügung. Da sich auch hier keine geeigneten Kristalle erzeugen ließen, wurde eine Zusammenarbeit mit der Gruppe von Maya Topf am CSSB in Hamburg initiiert, um die Komplexstruktur mittels Einzelpartikelanalyse durch Kryo-EM zu untersuchen. Zur Verbesserung des Partikelkontrasts in der Kryo-EM entwickelte ich auf Basis der vorhandenen Sybodies sogenannte Legobodies, die an pUL94/pUL99 binden. Dennoch zeigte der Komplex eine ausgeprägte heterogene Zusammensetzung und Konformation, was die erreichbare Auflösung auf etwa 6 Å begrenzte.
Abschließend nutzte ich die publizierten Strukturen des pentameren und monomeren pUL77, um einen Consensus-Screening-Workflow für pUL77 zu etablieren. Dabei kamen mehrere Scoring-Funktionen, Docking-Tools sowie ergänzende Selektionskriterien zum Einsatz. Dies ermöglichte die Identifizierung übereinstimmender Liganden-Posen aus zwei Docking-Programmen und erhöhte damit die Wahrscheinlichkeit für Treffer (true positives). Durch den Einsatz von Clustering-Algorithmen konnten die Moleküle weiter analysiert und die Rate potenzieller Wirkstofftreffer sowie die Auswahl von Leitstrukturen verbessert werden. Die aus dieser Screening-Workflow resultierenden Hitkandidaten wurden bereits bestellt und sollen nun von unseren Kooperationspartnern in zellulären HCMV-Infektionsmodellen getestet werden.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine effiziente Workflow für das virtuelle Screening niedermolekularer Substanzen mit verbesserten Trefferquoten etabliert, deren Ergebnisse über die konventionelle Bewertung mittels Docking-Scores hinausgehen. Dieser Ansatz soll die Effizienz der struktur-basierten antiviralen Wirkstoffforschung gegen HCMV signifikant steigern.
Schlagwörter
HCMV, drug discovery
Zitierform
Institut/Klinik
Institut für Biochemie