Schmidt-Jiménez, Leon Felipe2026-05-052026-05-052025https://epub.uni-luebeck.de/handle/zhb_hl/3643Autoantikörper (AAk) sind eine Hauptursachen für Autoimmunerkrankungen. Das Verständnis der Entstehung und molekularen Eigenschaften von AAk ist entscheidend für das Verständnis von AAk-vermittelten Autoimmunität. Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) ist eine schwere AAk-vermittelte autoimmune blasenbildende Erkrankung (AIBD), in der Akk Typ-VII-Kollagen (COLVII) an der dermal-epidermalen Junktionszone (DEJ) in der Haut binden. Bei der EBA führt die AAk-Ablagerung an der DEJ zu nachfolgenden Entzündungen, vermittelt durch die Effektordomäne der Akk. Trotz bedeutender Fortschritte im Verständnis der nachgeschalteten Pathomechanismen, bleibt die Ätiologie der AAk – deren Klonalität, Genetik und für die Pathogenität essentiellen Subklassenkomposition nur unzureichend charakterisiert. Monoklonale AAk, die in der Lage sind, die Enzündungsprozesse der EBA in Mausmodellen zu induzieren, wurden bisher nicht identifiziert und stellen eine bedeutende Lücke in der Chrakterisierung der Erkrankung dar. Diese Studie nutzte Phage-Display in Kombination mit Next-Generation-Sequenzierung (NGS), um monoklonale Maus Akk zu isolieren die gegen murines COLVII (mCOLVII) gerichtet sind um diese nachfolgend genetisch sowie funktional zu charakterisieren. Unter Verwendung von zwei Immunbanken, generiert aus lymphatischen Geweben einer mCOLVII-immunisierten Maus, wurden vier dominante variable Schwerketten (VH)-Klonotypen mit eingeschränkter genetischer Vielfalt identifiziert, was auf Einschränkungen in der autoreaktiven B-Zell-Antwort hindeutete. B-Zell-Rezeptor-Repertoire-Sequenzierung (BCR-seq) zeigte gewebespezifische Isotypverteilungen und Expansionsmuster, und erlaubte die Klonotypen in die Ursprungsgeweben zurück zu verfolgen. Durch BCR-seq wurde eine unerwartete Dominanz von IgG1 in hochmutierten Klonen identifiziert, welche das aktuelle Verständnis der Rollen von Antikörper Subklassen in der Pathogenese der EBA in Frage stellt. Ausgewählte Klone wurden im komplementaktivierenden IgG2b-Format exprimiert und Antigenspezifität sowie Funktionalität wurden in vitro nachgewiesen. Weitere mCOLVII-targetierende Klone wurden von Kooperationspartner erworben und analog exprimiert und charakterisiert. Die in vivo Validierung von sechs mittels Phage-Display identifizierten Klonen und zwei erworbener Klone zeigte DEJ-Bindung für alle und Komplementfaktor C3-Ablagerung für letztere; Bindung und Komplementaktivierung erwiesen sich jedoch als unzureichend für die klinische Krankheitsmanifestation, was auf zusätzliche Anforderungen für pathogene AAk jenseits der Zielerkennung und Komplementaktivierung hinweist. Diese Arbeit liefert wichtige Einblicke in die Genetik und Funktionalität von anti-mCOLVII AAk und schafft damit Grundlagen für das Verständnis der AAk-Pathogenitätsdeterminanten in der EBA, und liefert zusätzlich wertvolle Werkzeuge für das Verständnis gewebespezifischer AAk-Mechanismen.Autoantibodies (Aab) are a major cause of autoimmune diseases. Understanding the generation and molecular properties of Aab is pivotal to understanding Aab-mediated autoimmunity. Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) is a severe Aab-mediated autoimmune blistering disease (AIBD) characterized by Aab targeting type VII collagen (COLVII) at the dermal-epidermal junction (DEJ) in the skin. In EBA, Aab deposition at the DEJ leads to subsequent inflammation through effector functions mediated by the Aab constant region. Despite significant advances in understanding downstream pathomechanisms after Aab binding, the etiology of Aab — their clonal origins, genetic constraints, and subclass contributions determining pathogenicity remain poorly characterized. Monoclonal Aabs capable of inducing disease in murine models have not been identified, limiting mechanistic insights into Aab-mediated tissue damage. This study employed phage display coupled with next-generation sequencing (NGS) to isolate and characterize monoclonal antibodies (mAbs) targeting murine COLVII (mCOLVII). This represents the first comprehensive genetic-level analysis of the murine B cell receptor repertoire in EBA research, revealing germinal center-driven affinity maturation of autoreactive clones. Using two immune-libraries from lymphoid tissues of an mCOLVII-immunized mouse, four dominant variable heavy chain (VH) clonotypes with restricted genetic diversity were identified, suggesting constraints in the autoreactive B cell response. B cell receptor repertoire sequencing (BCR-seq) revealed tissue-specific isotype distribution and expansion patterns, while tracking clonotypes to originating tissues. BCR-seq uncovered an unexpected predominance of IgG1 in highly mutated clones in the draining lymph nodes (dLN), potentially challenging the current understanding of subclass roles in EBA pathogenesis. Selected clones were expressed in the complement-activating IgG2b format, demonstrating antigen specificity and constant region functionality in vitro. Additional mCOLVII-targeting clones were acquired from fellow researchers and likewise expressed and characterized. In vivo validation of six phage display-derived clones and two acquired clones revealed DEJ binding of all and complement C3 deposition for the latter; however, these molecular events proved insufficient for clinical disease manifestation, indicating additional requirements for pathogenic Aab beyond target recognition and complement activation. These findings suggest that synergistic epitope targeting, enhanced Fc-mediated effector functions or multiple subclasses may be required for clinical disease induction. This study provides critical insights into anti-mCOLVII Aab genetics and functionality, establishing foundations for understanding Aab pathogenicity determinants in EBA while providing valuable tools for understanding tissue-specific Aab mechanisms.enImmunologyDermatologyAutoimmune diseaseAutoantibodiesPhage displayBCR repertoireEpidermolysis bullosa aquisitaCollagen type VII500thesis.doctoralurn:nbn:de:gbv:841-202605051